定量限的概念解析
中國藥典2015年版四部通則9101對定量限概念的定義為：“定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應符合準確度和精密度要求。對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限……一般以信噪比為10:1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。”這一概念為目前定量限的主流定義，ICH與歐美日等各國相關指導原則對定量限定義都與此大致相同。
定量限驗證概述
上述概念對方法驗證中定量限驗證的做法有著重要的影響，定量限驗證的做法在近些年也發生了許多的變化，如早期主要的工作在于確認信噪比10的各組分濃度，演變為定量限也需要考察響應情況的精密度，直至目前主流的定量限還需要考察回收率的結果。
隨著定量限驗證內容的增加，定量限驗證過程中出現的問題也越來越多，具體驗證的做法也逐漸發生了變化，下面的章節討論驗證過程中出現的各種問題與由此引起的定量限驗證具體做法的變化。
定量限驗證異常情況1：連續進樣，出現信噪比小于10的數據
如上文所述在早期（如十年前）的方法驗證中，定量限驗證僅要求確認信噪比為10的各組分濃度，后來逐漸增加了考察信噪比為10的各組分定量限濃度下的響應情況的精密度研究。由此必然會引入一個風險，即樣品濃度一致信號響應大致相同，但是不能確保每次進樣的噪音都完全一致，遂出現信噪比在10附件波動的情況，可能某一次或數次信噪比小于10，不符合相關指導原則對定量限的定義“一般以信噪比為10:1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限”。
由于上述情況的出現，引起了許多人對定量限概念的思考，該階段的思考主要在以下幾個問題：
1、信噪比能說明什么？--定量限測不準原理
信噪比，顧名思義，就是組分響應信號與基線噪音的比值。我們都知道，液相色譜的響應值并不是一個固定值，會隨著儀器狀態（如氘燈能量）、不同品牌型號等差異導致響應信號不同；基線噪音也是如此，不同流動相、不同日期、不同儀器、不同類型檢測器、同一臺儀器不同狀態等都會導致噪音的值存在明顯的差異。通過以上分析可知，信噪比是一個隨機的不確定的值，那么這個值到底能說明什么問題？
上面的問題很難回答，但是有一點能確定，即方法驗證過程中找出來的信噪比10的濃度的溶液，換一臺儀器或者換流動相等參數，信噪比就極大可能不是10了，這是個幾乎不能重現的結果。換個角度分析，也可以說信噪比10的溶液濃度是不確定的。由此我們可以得出一個原理，即定量限測不準原理，該原理可以表述為以下的形式：以信噪比10為某個組分的定量限，則其濃度是不確定的；以某個確定的濃度為定量限，則其信噪比不一定總是10；即信噪比10與濃度二者必有一個是不確定的。
2、定量限的信噪比必須是10嗎？
由于定量限測不準原理，越來越多的人在質疑定量限信噪比10的規定的合理性，于是許多人逐漸摒棄了定量限信噪比10的規定，但是這些人中分出兩個主要的群體：一部分人有限摒棄該規定，具體做法是配制某個濃度（一般為限度的1/n，n≥2），在這個濃度下信噪比大于10，但是也不能偏離太多，一般不大于100；另一部分人為徹底摒棄，具體做法是配制某個濃度（一般為限度的1/n，n≥2），在這個濃度下信噪比大于10即可，以確認方法有足夠的靈敏度。
到目前為止，仍然有許多同仁陷在定量限信噪比10的坑里沒爬出來，我想對這些同仁說：“我們的軀體可以被束縛，但是思想不能被禁錮。”
3、 定量限為試樣中被測物能被定量測定的最低量，找出這個值有意義嗎？
提供雜質檢測的結果時，結果的接收方一般不關注方法能檢出的最低量，大多數只關注實測值或者是否超過限度，因此在實際檢測過程中，報告的雜質檢測結果小于一定的值之后就很可能沒有了意義，如原料藥有關物質檢測結果，某雜質限度為0.1%，報告的實際檢測結果為“0.0003%”與“小于0.02%”并沒有實際上的差別，都足以讓結果的接受方得出供試品中該雜質含量遠低于限度要求的判斷。因此ICH的相關指導原則中提出了報告限的概念，含量低于報告限的雜質在檢測結果中可以不必報告具體檢測值，如果遵循ICH相關指導原則的規定，確認分析方法在報告限濃度水平具有良好的靈敏度、精密度與準確度就足以滿足實際檢測需要。
由于定量限測不準原理的存在，被測物能被定量測定的最低量在實際檢測工作中是不穩定的隨機的值，因此方法驗證中確定該值并無太大的實質上的意義。
一般來說，沒有必要確定定量限，但是在某些情況下如藥代動力學研究過程中，待測樣品的含量可能是一個非常大的區間，對儀器與分析方法的定量限研究對于相關研究具有一定的指導意義，因此具有一定的積極意義，但仍然要充分評估各種條件變動對該值變化存在的風險。
定量限驗證異常情況2：回收率不符合規定
最近逐漸興起定量限需要做準確度驗證的做法，中國藥典2015年版四部通則9101對定量限概念的定義中明確提出定量限“其測定結果應符合準確度和精密度要求”，于是越來越多的人開始進行定量限濃度的回收率試驗。
定量限濃度的回收率試驗一般濃度小響應誤差大，回收率經常不符合規定，這屬于正常情況，可以理解；但是正常歸正常理解歸理解，可不符合規定就不符合指導原則要求的“測定結果應符合準確度要求”的定義，應該怎么處理呢？
1、放寬定量限回收率的可接受標準
以有關物質方法驗證為例，如果其他三個濃度水平的回收率可接受標準為80%~120%，則將定量限回收率可接受標準放寬至70%~130%；這是目前較為常見的一類做法，是上文中提到的未徹底摒棄信噪比10規定的同仁較常見的做法，似乎非常合理，定量限響應低誤差大，所以回收率相對放寬，很合理。但是…..事情總是有但是，從檢測結果的準確度角度來看，是否可以認為定量限濃度水平的檢測結果較其他濃度水平的檢測結果更加不準確？對于檢測結果準確度的要求可以這樣隨意更改嗎？那以后定量限水平的檢測結果是可信還是不可信？
如果深究的話，似乎放寬定量限回收率的做法也有一定的問題，而且這種放寬是非常隨意沒有什么依據的做法，由于該做法存在以上的矛盾，所以又有了另一種做法，如下：
2、提高定量限濃度
既然是由于濃度小響應誤差大導致回收率不符合規定，那么提高定量限濃度也就增加了響應減小了檢測誤差，則可避免由此導致的回收率不符合規定的情況。這種做法常見于上文提到的徹底摒棄信噪比10規定的同仁，定量限水平的回收率可接受標準同其他濃度水平，即其檢測結果的準確度同其他濃度水平。
該種做法的出現，可以說標志著定量限的概念已經千瘡百孔、名存實亡。為什么這么說？因為在該濃度下的信噪比可能已經達到了好幾百，遠大于指導原則中對于信噪比10的要求，這個濃度與定量限還有多大的關系？只是以定量限的名義對方法的靈敏度是否符合檢測要求的一次確認而已。于是筆者有了一個大膽的想法：
定量限驗證的概念應被放棄，代之以基于風險的理解對方法的靈敏度進行判斷
這種聳人聽聞的觀念應該會產生很大的沖擊，一定會有許多同仁不能接受，畢竟存在了這么多年深入人心的定量限概念，筆者竟敢信口開河說要徹底放棄，俗語說癩蛤蟆打哈欠—恁大的口氣！如果上文的內容還不足以說明定量限概念的不合時宜，筆者下文將會給出對定量限的致命一擊。
定量限概念的不嚴謹與局限性，給實踐帶來了各種各樣的困擾，上述驗證的各種問題只是其中一個方面，另一個方面體現在日常檢測工作中。定量限概念中要求“其測定結果應符合準確度和精密度要求”，這句話的本意是低于定量限的結果準確度與精密度皆不可知，從嚴謹的態度出發，日常檢測過程中，低于定量限的檢測結果不應被出示，也就是說如果某組分的實測結果小于定量限，在COA中不得出現數值的表現形式，而應表達為“小于定量限”。該要求有其先進性，但是它的局限性在于定量限測不準，也就是說日常檢測過程中不能知道定量限的具體值。或許有同仁會反駁說，QC實驗室在做方法轉移或者方法確認時會驗證定量限，同上文所述，方法轉移或者方法確認的定量限數據能適用所有的狀態嗎？
結合以上兩種情況，我們已經知道定量限的概念對驗證與日常檢測都帶來了無法逾越的障礙，所以它必須被徹底放棄，我們不提定量限不管信噪比10，我們只研究方法能達到的風險較低的具有準確度與精密度的最低允許的檢測結果，即方法的靈敏度應當符合要求。以有關物質為例，如果某個組分的限度為0.1%，如果0.02%水平下在響應最差的儀器中信噪比仍然達到100，且回收率驗證與精密度驗證均符合規定，則可以認為該數字可以適用于今后的日常檢測，即如果有小于0.02%的檢測結果，在COA中表述為“小于0.02%”，如果方法中規定了報告限或遵循ICH相關指導原則中報告限的規定，且0.02%小于報告限，也可表述為“小于報告限”。
如果方法的靈敏度存在風險，應當在系統適用性試驗中增加靈敏度的相關試驗。以有關物質為例，如某組分的限度0.1%，方法驗證時0.05%水平下信噪比20，回收率驗證與精密度驗證均符合規定，該水平為日常檢測報告的最低值，則在系統適用性試驗中應確認該組分0.05%水平下信噪比不小于20。
其他
方法的全生命周期的過程需要伴隨知識管理的過程，如上文所述在方法驗證期間確認的日常檢測最低報告值需要由方法驗證的負責人傳遞至QC相關人員。
限于經驗及知識的限制，筆者所述未必正確，如睿智的讀者有其他觀點，歡迎指點迷津。
如果各位讀者在方法驗證中有其他的異常情況，也歡迎分享，筆者會收集相關內容并進行原因分析。拜謝！
【來源：anytesting】
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